Identifikasi Secara Molekuler Bakteri Endofit dari N. altissima yang Bersifat Antagonis terhadap Bakteri Uji Penyebab Diare

 Sebanyak 218 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari tumbuhan N. altissima. Bakteri endofit yang diisolasi meliputi bakteri dan aktinomisetes. Jumlah bakteri endofit yang berhasil diisolasi dari setiap bagian tumbuhan bervariasi, ditunjukkan pada Tabel C.1. Sebanyak 56,21% isolat bakteri diperoleh dari daun, 27,56% isolat dari kulit batang, dan 16,21% isolat dari akar. Jumlah isolat bakteri yang berhasil diisolasi dari daun tua memiliki jumlah yang lebih banyak (94 isolat) dibandingkan dengan jumlah isolat bakteri dari daun muda (10 isolat).

            Dari 33 isolat aktinomisetes endofit asal tumbuhan N. altissima yang diperoleh, sekitar 6,06% isolat diperoleh dari kulit batang dan 93,94% isolat dari akar (Tabel C.1). Isolat aktinomisetes dari bagian kulit batang, semuanya merupakan mikroba potensial sebagai penghasil senyawa bioaktif antibakteri (Tabel C.2).

Hasil skrining aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa bakteri endofit dari N. altissima potensial memproduksi senyawa bioaktif yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri uji penyebab diare. Hal ini terlihat dari aktivitas antibakteri pada lima isolat bakteri endofit (strain UICC B-40, UICC B-91, UICC B-93, 79D dan 188A) mampu menghambat pertumbuhan semua bakteri uji penyebab diare yang digunakan dalam penelitian ini, seperti Bacillus cereus ATCC 10876, Eschericia coli ATCC 25922,  Salmonella typhimurium ATCC 25241, Shigella flexneri ATCC 12022 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923. Bakteri uji B. cereus adalah bakteri yang paling sensitif terhadap senyawa bioaktif  yang dihasilkan oleh isolat bakteri endofit strain UICC B-40, UICC B-91, UICC B-93, 79D dan 188A. Dalam uji aktivitas senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh isolat-isolat aktinomisetes endofit, diameter zona hambat yang dihasilkan oleh aktinomisetes endofit terhadap bakteri uji patogen tidak sebesar diameter zona hambat yang dihasilkan oleh aktivitas senyawa bioaktif dari bakteri endofit.

Berdasarkan kenampakan morfologi koloni [Gambar C.1 (a, b, c)],  isolat bakteri endofit UICC B-40 mirip dengan isolat bakteri endofit UICC B-93 yaitu koloninya tampak bulat kecil dan memproduksi pigmen yang berfluorescent biru kehijauan pada Nutrient Agar (NA). Sementara itu, koloni dari isolat bakteri endofit UICC B-91 memiliki struktur seperti tombol, bentuk koloni bulat dengan diameter yang relatif lebih besar dibandingkan isolat UICC B-40 dan UICC B-93. Koloni isolat bakteri endofit UICC B-91 tampak menghasilkan pigmen coklat kekuningan. Koloni isolat bakteri endofit UICC B-91 memiliki keunikan tersendiri tentang konsistensinya yaitu tampak lengket seperti lem. Uji biokimia menunjukkan bahwa semua bakteri endofit potensial diperoleh hasil positif untuk uji Voges-Proskauer (VP). Hal ini berarti bakteri endofit potensial tersebut mampu menghasilkan produk akhir yang tidak bersifat asam atau netral seperti acetylmethylcarbinol (asetolin) sebagai hasil fermentasi glukosa yang merupakan karakteristik dari Genus Enterobacter.

Berdasarkan hasil pengamatan makroskopik [Gambar C.1 (d,e)], pada isolat aktinomisetes endofit UICC B-94 memiliki miselium substrat berwarna coklat. Hanya isolat aktinomisetes endofit UICC B-92 yang memiliki miselium substrat hitam namun kenampakan morfologinya terlihat putih karena memiliki miselium aerial putih keabu-abuan. Kenampakan morfologi rantai spora untuk isolat aktinomisetes endofit UICC B-92 bertipe posisporus ireguler dan pilimelia silindrikal. Berdasarkan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Buchanan & Gibbons 1974), aktinomisetes dapat dikelompokkan berdasarkan pada pengamatan beberapa ciri morfologi, yang mencakup beberapa karakter seperti warna miselium aerial, miselium substrat, produksi pigmen melanoid, morfologi spora dan rantai spora. Aktinomisetes apabila ditumbuhkan pada media agar akan membentuk  jaringan percabangan hifa yang tumbuh pada permukaan substrat dan ke dalam substrat lalu berkumpul menjadi miselium substrat. Sebagian besar aktinomisetes juga memiliki miselium udara (aerial) yang membentang di atas permukaan medium (Prescott et al. 2002). Berdasarkan hasil pengamatan makroskopik [Gambar C.1 (d,e)], isolat aktinomisetes endofit UICC B-92 memiliki miselium substrat hitam namun kenampakan morfologinya terlihat putih karena memiliki miselium aerial putih keabu-abuan. Kenampakan morfologi rantai spora untuk isolat aktinomisetes endofit UICC B-92 bertipe posisporus tidak beraturan dan pilimelia berbentuk silinder.

Pohon filogenetik dihasilkan dari sekuen 16SrRNA menunjukkan bahwa 3 isolat potensial terdapat dalam clade seluas clade sekuen yang dimiliki oleh genus Pseudomonas (Gambar C.2). Sekuen isolat UICC B-40 dan UICC B-93 terdapat di clade yang memiliki type strain P. aeruginosa dengan 100% bootstrap support (BS), sementara itu sekuen dari isolat UICC B-91 membentuk suatu monophyletic clade dengan P. azotoformans strain NBRC 12693 (95% BS). Hal tersebut tampak jelas bahwa sekuen dari isolat bakteri endofit UICC B-40 dan UICC B-93 merupakan spesies P. aeruginosa dan sekuen dari isolat bakteri endofit UICC B-91 merupakan spesies P. azotoformans.

Berdasarkan Gambar C.3, diketahui bahwa isolat aktinomisetes endofit UICC B-92 memiliki kekerabatan paling dekat dengan Streptomyces sampsonii  strain NBRC 13083, S. albidoflavus strain NBRC 13010, S. daghestanicus strain NRRL B-5418, S. globisporus subsp. caucasicus strain NBRC 100770, S. coelicolor strain NBRC 12854, S. limosus strain NBRC 12790, S. canescens strain NBRC 12751, S. resistomycificus strain ISP 5133, S. felleus strain NBRC 12766, S. odorifer strain NBRC 13365, S. griseochromogenes strain ISP 5499, S. champavatii strain NRRL B-5682, dan S. violascens strain CSSP 183 dengan nilai bootstrap sebesar 99%. Berdasarkan Gambar C.4, isolat aktinomisetes endofit UICC B-94 berada di dalam satu klade dengan Nonomuraea jabinensis strain A4036 dan N. rubra strain AC 615 dengan nilai bootstrap yang rendah, yaitu hanya sebesar 18%. Berdasarkan analisis dari pohon filogenetik tersebut, kedua isolat aktinomisetes tersebut belum dapat diidentifikasi sampai tingkat spesies, hanya sampai tingkat genus. Isolat aktinomisetes endofit UICC B-92 termasuk kedalam Streptomyces sp., sedangkan isolat UICC B-94 adalah Nonomuraea sp. Keduanya diduga merupakan spesies yang baru.